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Enzyme

Neutronenstruktur des Enzyms DFPase

Neutronendichtekarten der DFPaseNeutronendichte für verschiedene Bereiche der DFPase

Die Protein Data Bank (PDB) hat im vergangenen Jahr die Zahl von 50.000 Einträgen überschritten. Die meisten dieser Proteinstrukturen wurden mit Hilfe der Röntgenkristallographie gewonnen, ein kleinerer Teil mit Hilfe der Kernmagnetischen Resonanzspektroskopie (NMR). DIe Zahl der publizierten Neutronenbeugungsstrukturen ist im Vergleich dazu verschwindend gering. Obowhl die erste Neutronenstruktur bereits 1969 von Benno Schoenborn gelöst wurde (Myoglobin des Pottwals, dem selben Protein mit dem John Kendrew zehn Jahre zuvor die erste Röntgenstruktur glückte) sind bis heute nur ca. 20 Proteine mit Hilfe der Neutronenbeugung charackterisiert worden.

Dabei bietet die Neutronenbeugung gegenüber der Verwendung von Röntgenstrahlen einen eindeutigen Vorteil. Während Wasserstoffatome in Röntgenstrukturen in der Regel unsichtbar sind können sie mit Neutronen dargestellt werden. Damit wird die Bestimmung von Protonierungszuständen von Aminosäureseitenketten und die Bestimmung der Orientierung von Wassermolekülen möglich. Gerade für das Verständnis von Enzymmechanismen ist dies von großer Bedeutung. Warum aber gibt es dann so wenige Neutronenstrukturen? Dies liegt daran, dass der Neutronenfluss von selbst leistungsfähigen Neutronenquellen gering ist im Vergleich zum Photonenfluss moderner Synchrotone. Daher sind für die Aufnahme von Datensätzen große Proteinkristalle und lange Messzeiten notwendig. Darüber hinaus stehen weltweit im Moment nur drei Messplätze für Proteine zur Verfügung (in den USA, Frankreich und Japan).

Die Bestimmung der Neutronenstruktur des Enzyms Diisopropylfluorophosphatase (DFPase) gelang an der Spallationsneutronenquelle des Los Alamos National Laboratory (LANL) mit einem der kleinsten Kristalle die für solche Untersuchungen erfolgreich verwendet wurden. Er hatte ein Volumen von 0,43 mm³. Für die Aufnahme eines kompletten Datensatzes befand sich der Kristall für etwa einen Monat im Strahl. Die gepulste Spallationsquelle in Los Alamos ermöglicht dabei die Verwendung von time-of-flight (TOF) Techniken. Die Struktur wurde in der PDB unter Zugangscode 3BYC hinterlegt.

Rapid determination of hydrogen positions and protonation states of diisopropyl fluorophosphatase by joint neutron and X-ray diffraction refinement.
Blum MM, Mustyakimov M, Rüterjans H, Kehe K, Schoenborn BP, Langan P, Chen JC.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Jan 20;106(3):713-8.
http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0807842106

Abstract:
Hydrogen atoms constitute about half of all atoms in proteins and play a critical role in enzyme mechanisms and macromolecular and solvent structure. Hydrogen atom positions can readily be determined by neutron diffraction, and as such, neutron diffraction is an invaluable tool for elucidating molecular mechanisms. Joint refinement of neutron and X-ray diffraction data can lead to improved models compared with the use of neutron data alone and has now been incorporated into modern, maximum-likelihood based crystallographic refinement programs like CNS. Joint refinement has been applied to neutron and X-ray diffraction data collected on crystals of diisopropyl fluorophosphatase (DFPase), a calcium-dependent phosphotriesterase capable of detoxifying organophosphorus nerve agents. Neutron omit maps reveal a number of important features pertaining to the mechanism of DFPase. Solvent molecule W33, coordinating the catalytic calcium, is a water molecule in a strained coordination environment, and not a hydroxide. The smallest Ca-O-H angle is 53°, well beyond the smallest angles previously observed. Residue Asp-229, is deprotonated, supporting a mechanism involving nucleophilic attack by Asp-229, and excluding water activation by the catalytic calcium. The extended network of hydrogen bonding interactions in the central water filled tunnel of DFPase is revealed, showing that internal solvent molecules form an important, integrated part of the overall structure.

Diskussion

Ein Kommentar für “Neutronenstruktur des Enzyms DFPase”

  1. Per aspera ad astra, Glückwunsch zum Erfolg!
    Ihr Roland Dierstein

    Geschrieben von Roland Dierstein | März 17, 2009, 08:12

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