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Analytik

Reaktionsverfolgung mittels FTIR-Spektroskopie

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Versuchsanordnung mit ReactIR 4000

Eine neue Veröffentlichung in der Zeitschrift Analytical Biochemistry beschreibt die Anwendung von in-situ FTIR-Spektroskopie zur Verfolgung des Abbaus von hochtoxischen Organophosphorverbindungen durch das Enzym DFPase. Die Verwendung von Attenuated Total Reflexion (ATR) ermöglich die Messung direkt in der Lösung, ohne dass Küvetten notwendig sind. Im Vergleich zu bisher verwendeten Verfahren, ist es möglich das Reaktionsvolumen deutlich zu reduzieren, was mit einer Reduzierung der Giftmenge und damit einem deutlichen Gewinn an Arbeitsicherheit verbunden ist. Das Detektionsprinzip beruht auf den unterschiedlichen IR-Absorbtionsbanden von Organophosphat und Hydrolyseprodukt. Wir konnten zeigen, dass die Veränderungen in den IR-Banden direkt proportional zu den Konzentrationsänderungen in der Lösung sind, das Lambert-Beersche Gesetz also gültig ist. Die Bestimmungsgrenze der Methode liegt bei ca. 1 mM. Dies ist ein deutlicher Fortschritt in Vergleich zu früheren Arbeiten zur in-situ FTIR-Spektroskopie. Dadd und Mitarbeiter hatten die Methode für die Verfolgung der Umsetzung von Nitrilen untersucht (Dadd et al., J. Microbiol. Methods 2000; 41:69-75), benötigten aber Substratkonzentrationen im Bereich von etwa 250 mM. Als Gerät wurde von uns ein ReactIR 4000 der Firma Mettler-Toledo verwendet.

Quantification of hydrolysis of toxic organophosphates and organophosphonates by diisopropyl fluorophosphatase from Loligo vulgaris by in situ Fourier transform infrared spectroscopy.
Gäb J, Melzer M, Kehe K, Richardt A, Blum MM.
Anal Biochem. 2009; 385(2):187-193.
http://dx.doi.org/10.1016/j.ab.2008.11.012

Abstract:
The enzyme diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) from the squid Loligo vulgaris effectively catalyzes the hydrolysis of diisopropyl fluorophosphate (DFP) and a number of organophosphorus nerve agents, including sarin, soman, cyclosarin, and tabun. Up to now, the determination of kinetic data has been achieved by techniques such as pH-stat titration, ion-selective electrodes, and fluorogenic substrate analogs. We report a new assaying method using in situ Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy with attenuated total reflection (ATR) for the real-time determination of reaction rates. The method employs changes in the P-O-R stretching vibration of DFP and nerve agent substrates when hydrolyzed to their corresponding phosphoric and phosphonic acids. It is shown that the Lambert-Beer law holds and that changes in absorbance can be directly related to changes in concentration. Compared with other methods, the use of in situ FTIR spectroscopy results in a substantially reduced reaction volume that adds extra work safety when handling highly toxic substrates. In addition, the new method allows the noninvasive measurement of buffered solutions with varying ionic strengths complementing existing methods. Because the assay is independent of the used enzyme, it should also be applicable to other phosphotriesterase enzymes such as organophosphorus hydrolase (OPH), organophosphorus acid anhydrolase (OPAA), and paraoxonase (PON).

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