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Umkehrung der Enantioselektivität der DFPase durch rationales Proteindesign

Händigkeit von Enantiomeren„Händigkeit“ von Enantiomeren am Beispiel
von Aminosäuren (Bildquelle: Wikipedia/NASA)

Das Enzyme Diisopropyl Fluorophosphatase (DFPase) katalysiert die Hydrolyse nicht nur von Diisopropyl Fluorophosphat (DFP) sondern auch von einer Reihe hochtoxischer Nervenkampfstoffe der sog. G-Reihe. Zu diesen Kampstoffen gehören Tabun (GA), Sarin (GB), Soman (GD) und Cyclosarin (GF). Während DFP keinerlei Stereozentren enthält weisen alle genannten G-Kampfstoffe vier unterschiedliche Gruppen am Phosphoratom auf. Daher ist dieses Phosphoratom asymmetrisch und ein Stereozentrum. GA, GB und GF sind daher chiral und liegen als Enantiomerenpaare vor, die sich zu einander wie linke und rechte Hand verhalten (bei GD sind die Verhältnisse noch etwas komplizierter, da es ein weiteres Stereozentrum in einer Seitenkette gibt).

Bei chemischen Reaktionen wie der wässrigen Hydrolyse in alkalischen Lösungen unterscheiden sich diese Enantiomeren nicht, aber bei der Interaktion mit ebenfalls chiralen Molekülen wie z.B. Proteinen zeigen sie unterschiedliche Eigenschaften. Dies zeigt sich bei der Hemmung des Enzyms Acteylcholinesterase (AChE), dem „Hauptangriffsort“ der Kampfstoffe. Hier zeigt ein Enantiomere eine deutlich stärkere Hemmwirkung, während das andere nur mäßig oder praktisch gar nicht hemmt. Bei der katalytischen Hydrolyse durch DFPase zeigt sich ebenfalls so ein Effekt. Der Wildtyp der DFPase baut vorzugsweise das weniger giftige Stereoisomer ab. Dies ist insbesondere bei medizinischen Anwendungen (in vivo oder auf der Haut) nachteilig, da es hier um eine möglichst schnelle Reduzierung der Toxizität geht. Die gezielte Veränderung der DFPase durch Mutagenese ist dabei eine mögliche Strategie zur Umkehrung der Enantioselektivität.

Model des Phosphoenzymintermediats der DFPase für das Substrat SarinModel des Phosphoenzymintermediats der
DFPase für das Substrat Sarin

Aufgrund der Beschränkungen die bei der Verwendung hochtoxischer Stoffe gelten* war die Durchführung von evolutionärer Mutagense mit nachfolgendem Hochdurchsatz-Screening der erzeugten Mutantenbibiotheken kein gangbarer Weg. Daher entschieden wir uns für rationales Protein Design. Dabei ist anzumerken, dass die Umkehrung der Enantioselektivität eines Enzyms keine triviale Aufgabe ist und die Zahl der bisher zu diesem Thema veröffentlichten Arbeiten überschaubar ist. Bei der Konstruktion der Mutanten war es allerdings möglich, sich auf umfassende Kenntnisse zur Struktur des Enzyms und zumReaktionsmechanismus zu stützen, der über ein Phosphoenzymintermediat verläuft.

Es gelang schließlich Mutanten zu generieren, die die gewünschte Umkehrung der Enantioselektivität zeigen. Diese Umkehrung ging dabei nicht zu Lasten der Enzymaktivität. Vielmehr zeigen die Mutanten höhere spezifische Aktivitäten als der Wildtyp. Eine optimale Kombination aus Selektivität, Aktivität und Substrataffinität wird durch Mischungen von Wildtyp und Mutante erreicht. Hier konnten selbst bei niedrigen Substratkonzentrationen die Reaktionszeiten für die vollständige Hydrolyse beider Enantiomere um das vierfache verkürzt werden, wobei es zu einem stark beschleunigten Abfall der Toxizität kommt, da in der ersten Phase der Umsetzung bevorzug das giftige Stereoisomer abgebaut wird.

Die Strukturen der Mutanten wurde in der PDB unter den Zugangscodes 3HLI und 3HLH hinterlegt.

* Die Arbeiten mit Nervenkampfstoffen wurden in Übereinstimmung mit den Regeln des Chemiewaffenübereinkommens in Kooperation mit dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr durchgeführt.

Reversed Enantioselectivity of Diisopropyl Fluorophosphatase against Organophosphorus Nerve Agents by Rational Design.
Melzer M, Chen JC, Heidenreich A, Gäb J, Koller M, Kehe K, Blum MM.
J. Am. Chem. Soc. 2009;131(47):17226-17232.
http://dx.doi.org/10.1021/ja905444g

Research Highlight in Nature Chemistry:
Nature Chem. 2010;2(1):4-5.
http://dx.doi.org/110.1038/nchem.487

Abstract:
Diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) from Loligo vulgaris is an efficient and robust biocatalyst for the hydrolysis of a range of highly toxic organophosphorus compounds including the nerve agents sarin, soman, and cyclosarin. In contrast to the substrate diisopropyl fluorophosphate (DFP) the nerve agents possess an asymmetric phosphorus atom, which leads to pairs of enantiomers that display markedly different toxicities. Wild-type DFPase prefers the less toxic stereoisomers of the substrates which leads to slower detoxification despite rapid hydrolysis. Enzyme engineering efforts based on rational design yielded two quadruple enzyme mutants with reversed enantioselectivity and overall enhanced activity against tested nerve agents. The reversed stereochemical preference is explained through modeling studies and the crystal structures of the two mutants. Using the engineered mutants in combination with wild-type DFPase leads to significantly enhanced activity and detoxification, which is especially important for personal decontamination. Our findings may also be of relevance for the structurally related enzyme human paraoxonase (PON), which is of considerable interest as a potential catalytic in vivo scavenger in case of organophosphorus poisoning.

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