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Analytik

Stabile Addukte von Nervenkampfstoffen mit Puffersubstanzen wie TRIS und HEPES

Reaktionsmechanismus der Bildung von Pufferaddukten mit Nervenkampfstoffen

Mechanismus der Adduktbildung

Puffersubstanzen dienen der Aufrechterhaltung eines bestimmten pH-Werts in Lösung. Neben der Pufferkapazität und der pH-Stabilität über längere Zeit ist ein weiter wichtiger Faktor bei der Auswahl einer Puffersubstanz ihre Nicht-Reaktivität mit anderen Komponenten der Lösung. In einer neuen Veröffentlichung in der Zeitschrift Journal of Chrmatography B berichten wir über die Bildung von stabilen Addukten von Nervenkampfstoffen wie Sarin, Soman oder Cyclosarin mit im Labor üblichen Puffersubstanzen wie TRIS, TES oder HEPES. Die Reaktion verläuft in Konkurrenz zur spontanen Hydrolyse der Nervenkampfstoffe und kann zu Ausbeuten von bis zu über 40% in Bezug auf das vorhandene Organophosphat/phosponat führen.

Bei der Verwendung einer kürzlich von uns vorgestellten NMR-Methode zur Verfolgung des Abbaus von Nervenkampfstoffen mit Enzymen in gepufferter Lösung beobachteten wir das Entstehen einer neuen, phosphorhaltigen und hydrolysestabilen Verbindung. Mit Hilfe von LC-ESI-MS/MS Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass es sich um Addukte zwischen Puffer und Nervenkampfstoff handelt. Nun können Puffersubstanzen wie TES oder TRIS sowohl als Stickstoffnukleophile (über die Aminogruppe) als auch als Sauerstoffnukleophile (über die Sauerstoffatome der Hydroxylgruppen) wirken. Die Identifizierung der Pufferaddukte als Phosphordiester („O-Addukte“) gelang wiederum mittels NMR-Spektroskopie.

Als möglichen Reaktionsmechanismus schlagen wir vor, dass die Aminogruppe des Puffers als intramolekularer Protonenakzeptor fungiert, der ein Proton von einer der Hydroxylgruppen des Puffers aufnehmen kann. Hierdurch erhöht sich die Nukleophilie dieses Sauerstoffatoms, dass das Phosphoratom des Kampfstoffs angreift und zur Bildung eines Phosphodiesters (im Fall der Organophosphonate wie Sarin, Soman und Cyclosarin) führt. Als alternative Puffersubstanzen für die Arbeit mit Nervenkampfstoffen schlagen wir Substanzen wie MOPS (pK = 7,2), CHES (pK = 9,3) und MES (pK = 6,15) vor. Diese weisen keine Kombination von Amino- und Hydroxylgruppen auf und zeigten im Experiment keine Adduktbildung.

Stable adducts of nerve agents sarin, soman and cyclosarin with TRIS, TES and related buffer compounds–Characterization by LC-ESI-MS/MS and NMR and implications for analytical chemistry.
Gäb J, John H, Melzer M, Blum MM.
J. Chromatogr. B 2010; 878(17-18):1382-1390.
http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2010.01.043

Abstract:
Buffering compounds like TRIS are frequently used in chemical, biochemical and biomedical applications to control pH in solution. One of the prerequisites of a buffer compound, in addition to sufficient buffering capacity and pH stability over time, is its non-reactivity with other constituents of the solution. This is especially important in the field of analytical chemistry where analytes are to be determined quantitatively. Investigating the enzymatic hydrolysis of G-type nerve agents sarin, soman and cyclosarin in buffered solution we have identified stable buffer adducts of TRIS, TES and other buffer compounds with the nerve agents. We identified the molecular structure of these adducts as phosphonic diesters using 1D 1H-31P HSQC NMR and LC-ESI-MS/MS techniques. Reaction rates with TRIS and TES are fast enough to compete with spontaneous hydrolysis in aqueous solution and to yield substantial amounts (up to 20-40%) of buffer adduct over the course of several hours. A reaction mechanism is proposed in which the amino function of the buffer serves as an intramolecular proton acceptor rendering the buffer hydroxyl groups nucleophilic enough for attack on the phosphorus atom of the agents. Results show that similar buffer adducts are formed with a range of hydroxyl and amino function containing buffers including TES, BES, TRIS, BIS-TRIS, BIS-TRIS propane, Tricine, Bicine, HEPES and triethanol amine. It is recommended to use alternative buffers like MOPS, MES and CHES when working with G-type nerve agents especially at higher concentrations and over prolonged times.

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