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Enzyme

Charakterisierung der katalytischen Calciumbindungsstelle der DFPase und Vergleich mit anderen beta-propeller Enzymen

Katalytische Calciumbindungsstelle der DFPase

Katalytische Ca-Bindungsstelle der DFPase

Das Enzym DFPase ist strukturell sehr gut beschrieben. Es ist sowohl eine Röntgenstruktur in atomarer Auflösung, als auch eine Neutronenstruktur verfügbar. Daneben wurde eine ganze Reihe von Mutanten der DFPase erzeugt, von denen einige auch per Röntgenbeugung strukturell untersucht werden konnten. Was bisher fehlte war eine systematische Betrachtung der katalytischen Calciumbindungsstelle der DFPase in Bezug auf katalytische Aktivität und der Fähigkeit zur Metallbindung. Eine Zusammenfassung bereits bekannter Daten, sowie drei neue Kristallstrukturen von Mutanten die Reste der Metallbindungsstelle verändern wurden nun in einem Artikel im Journal Chemico-Biological Interactions veröffentlicht. Hieraus konnten Regeln für Aktivität und Metallbindung abgeleitet werden.

Ein Vergleich mit den strukturell ähnlichen Proteinen Paraoxonase (PON1), Drug Resistance Protein 35 (Drp35) aus S. aureus oder der Gluconolactonase XC5397 aus Xanthomonas campestris zeigt Calciumbindungstellen mit fast identischer Topologie, zum Teil aber unterschiedlichen enzymatischen Aktivitäten (PON1 ist auch ein Phosphotriesterase aber die nativen Substrate von PON1, Drp35 und XC5397 scheinen Laktone zu sein). Die mögliche Übertragbarkeit der für die DFPase gefunden Regeln auf die anderen Proteine wird diskutiert.

Structural characterization of the catalytic calcium binding site in diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) and comparison with related β-propeller enzymes.
Blum MM, Chen JC.
Chem. Biol. Interact. 2010; 187(1-3):373-379.
http://dx.doi.org/10.1016/j.cbi.2010.02.043

Abstract:
The calcium-dependent phosphotriesterase diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) from the squid Loligo vulgaris efficiently hydrolyzes a wide range of organophosphorus nerve agents. The two calcium ions within DFPase play essential roles for its function. The lower affinity calcium ion located at the bottom of the active site participates in the reaction mechanism, while the high affinity calcium in the center of the protein maintains structural integrity of the enzyme. The activity and structures of three DFPase variants targeting the catalytic calcium-binding site are reported (D121E, N120D/N175D/D229N, and E21Q/N120D/N175D/D229N), and the effect of these mutations on the overall structural dynamics of DFPase is examined using molecular dynamics simulations. While D229 is crucial for enzymatic activity, E21 is essential for calcium binding. Although at least two negatively charged side chains are required for calcium binding, the addition of a third charge significantly lowers the activity. Furthermore, the arrangement of these charges in the binding site is important for enzymatic activity. These results, together with earlier mutational, structural, and kinetic studies, show a highly evolved calcium-binding environment, with a specific electrostatic topology crucial for activity. A number of structural homologues of DFPase have been recently identified, including a chimeric variant of Paraoxonase 1 (PON1), drug resistance protein 35 (Drp35) from Staphylococcus aureus and the gluconolactonase XC5397 from Xanthomonas campestris. Surprisingly, despite low sequence identity, these proteins share remarkably similar calcium-binding environments to DFPase.

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