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Röntgenstruktur von perdeuterierter DFPase – Perdeuterierung von Proteinen für Neutronenbeugungexperimente

Plot der RMSD Werte für C-alpha Kohlenstoffatome zwischen d-DFPase und h-DFPase

Plot der RMSD Werte für C-α Kohlenstoffatome zwischen d-DFPase und h-DFPase

Neutronenbeugungsstrukturen von Proteinen haben in Vergleich zu Röntgenstrukturen den großen Vorteil, dass in ihnen auch Wasserstoffatome sichtbar gemacht werden. Dies ermöglicht Aussagen über Protonierungszustände von Aminosäureseitenketten sowie über die Ausrichtung einzelner Solvensmoleküle. Dies ist insbesondere zur Aufklärung von Enzymmechanismen von großer Bedeutung. Der Nachteil der Neutronenbeugung liegt in der geringen Anzahl geeigneter Instrumente weltweit und Ihrem (im Vergleich zu Röntgenquellen) kleinen Neutronenfluss. Daher werden sehr große Proteinkristalle benötigt und die Zeiten für die Ausnahme eines Datensatzes können leicht bei mehreren Wochen liegen. Ein weiteres Problem ist das Signal-Rausch-Verhältnis bei der Datenaufnahme. Hier sind insbesondere die Wasserstoffatome im Kristall problematisch, da Wasserstoff einen großen inkohärenten Streuquerschnitt aufweist. Dieser Streuquerschnitt, der bei hohen Werten zu diffuser Streuung führt, ist beim Wasserstoffisotop Deuterium deutlich geringer (2.05 b für Deuterium verglichen mit 80.27 b für normalen Wasserstoff; 1 b = 100 fm²). Daher wird bei Neutronenexperimenten der zu vermessende Kristall gewöhnlich mit deuterierter Mutterlauge in Kontakt gebracht (in der Regel über Diffusion über die Gasphase). Hierbei tauschen die labilen Wasserstoffatome (z.B. die des Solvens und Wasserstoff an sauren bzw. basischen Seitenketten) gegen Deuterium aus. Nichtlabile Wasserstoffatome, wie sie z.B. in aliphatischen oder aromatischen C-H Bindungen auftreten, tauschen hingegen nicht aus. Daher verbleibt ein gewisser Anteil an Wasserstoff im Protein ohne Austausch.

Cover von Acta F mit DFPase

Cover von Acta F mit DFPase

Ein solcher partiell ausgetauschter Kristall wurde für die bereits publizierte Neutronenstruktur der DFPase verwendet.

Um eine vollständige Deuterierung des Proteins zu erreichen, muss dieses in volldeuteriertem Medium exprimiert werden. Über die Röntgenbeugungsstruktur von perdeuterierter DFPase berichten wir nun in einer neuen Veröffentlichung im Journal Acta Cryst. F. Die Struktur (bei Raumtemperatur in einer Auflösung von 2.1 Å gelöst) zeigt, dass die vollständige Deuterierung zu praktisch keinen Veränderungen in der Proteinstruktur führt. Doch obwohl ein großer Kristall gezüchtet werden konnte (> 2mm³), beugte dieser im Neutronenexperiment praktisch gar nicht. Eine Erklärung für dieses erstaunliche Resultat kann in der Datenaufnahme (Querschnitt des Neutronenstrahls im Vergleich zum Röntgenstrahl) liegen. Ein weiter Erklärungsversuch zielt auf kristallographische Parameter ab. Die Beugungscharakteristiken von erfolgreichen Neutronenbeugungsexperimenten und den dazu gehörigen Röntgendaten werden tabelliert dargestellt und geben einen Anhalt für zukünftige Neutronenexperimente.

X-ray structure of perdeuterated diisopropyl fluorophosphatase (DFPase): Perdeuteration of proteins for neutron diffraction.
Blum MM, Tomanicek S, John H, Hanson L, Rüterjans H, Schoenborn BP, Langan P, Chen JC.
Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 2010; 66(4):379-385.
http://dx.doi.org/10.1107/S1744309110004318

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Abstract:
The signal-to-noise ratio is one of the limiting factors in neutron macromolecular crystallography. Protein perdeuteration, which replaces all H atoms with deuterium, is a method of improving the signal-to-noise ratio of neutron crystallography experiments by reducing the incoherent scattering of the hydrogen isotope. Detailed analyses of perdeuterated and hydrogenated structures are necessary in order to evaluate the utility of perdeuterated crystals for neutron diffraction studies. The room-temperature X-ray structure of perdeuterated diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) is reported at 2.1 Å resolution. Comparison with an independently refined hydrogenated room-temperature structure of DFPase revealed no major systematic differences, although the crystals of perdeuterated DFPase did not diffract neutrons. The lack of diffraction is examined with respect to data-collection and crystallographic parameters. The diffraction characteristics of successful neutron structure determinations are presented as a guideline for future neutron diffraction studies of macromolecules. X-ray diffraction to beyond 2.0 Å resolution appears to be a strong predictor of successful neutron structures.

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