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Enzyme

Neutronenstruktur und mechanistische Untersuchungen der DFPase

Verschiedene diskutierte Reaktionsmechanismen der DFPase

Diskutierte Reaktionsmechanismen der DFPase

Kenntnisse über den Reaktionsmechanismus des Enzyms DFPase sind von entscheidender Bedeutung für Erfolgsaussichten von gerichtetem Proteindesign, denn dieser gibt die Orientierung von Substraten in der Bindungstasche des Enzyms für die erfolgreiche Umsetzung zum Produkt vor. Darüber können für den Mechanismus wichtige Aminosäuren gezielt optimiert werden. Im Fall der DFPase wurden in der Vergangenheit drei verschiedene Mechanismen diskutiert.

Als im Jahr 2001 die erste Röntgenbeugungsstruktur des Enzyms publiziert wurde (Scharff et al., Structure 9 (2001) 493-502), fand man den Histidinrest H287 der Teil der Bindungstasche war. Die Mutation H287N zeigte nur minimale enzymatische Aktivität. Daher wurde postuliert, dass H287 ein Wassermolekül aktiviert, das wiederum das über den Phosphorylsauerstoff and das Calciumion koordinierte Substratmolekül am Phosphoratom nukleophil angreift (oberstes Schema in der Abbildung). Da Mutationen wie H287F jedoch enzymatisch Aktiv sind musste dieser Mechanismus verworfen werden.

Alternativ wurde vorgeschlagen, dass das Calciumion in der katalytischen Bindungstasche der DFPase direkt ein koordiniertes Wasser aktiviert (und dieses als Hydroxidion vorliegt). Dieses Hydroxidion soll dann als Nukleophil das Phosphoratom des ebenfalls an das Calciumion koordinierten Substratmoleküls angreifen (mittleres Schema in der Abbildung). Dieser Mechanismus konnte durch die Neutronenbeugungsstruktur der DFPase wiederlegt werden, in der eindeutig das entsprechende koordinierte Wasser als Wassermolekül und nicht als Hydroxidion vorliegt. Wichtig ist in diesem Zusammenhang der Hinweis, dass die Neutronendaten (und entsprechende Röntgendaten für das „Joint Refinement“) bei Raumtemperatur aufgenommen wurden, also bei der für die katalytische Aktivität relevanten Temperatur. Die Neutronenstruktur ist allerdings im Einklang mit einem dritten Mechanismus, der auf der Grundlage von Isotopenmarkierung, Mutationsstudien und der Struktur eines Inhibitorkomplexes vorgeschlagen wurde.

Cover des Sonderbands von ActaD

Sonderband von Acta D

Dieser Mechanismus (Blum et al., JACS 128 (2006) 12750-12757) identifiziert den calciumkoordinierenden Rest D229 als das angreifende Nukleophil. Als Intermediat wird dabei ein energiereiches und instabiles Phosphoenzymintemediat gebildet, das wiederum durch Wasser hydrolysiert wird, wobei das Enzym regeneriert und das Produkt freigesetzt wird (unterstes Schema in der Abbildung).

Die Ergebnisse der Neutronenbeugungsstruktur der DFPase sowie von Mutations- und Kinetikstudien haben wir nun in einer Veröffentlichung im Journal Acta Cryst. D zueinander in Beziehung gesetzt. Der Artikel ist Teil eines Sonderbandes mit dem Titel „Neutrons in Biology„. Obwohl alle Artikel des Bandes lesenswert sind und einen tieferen Einblick in den aktuellen Stand der Forschung mit Neutronen an Biomakromolekülen erlauben, sei doch ein Artikel besonders zur Lektüre empfohlen: Benno P. Schoenborn, der Ende der 60er Jahre die erste Neutronenstruktur von Myoglobin publizierte (und damit die erst Neutronenstruktur eines Proteins überhaupt), bietet in seinem Artikel mit dem Titel „A history of neutrons in biology: the development of neutron protein crystallography at BNL and LANL“ einen faszinierenden Überblick über die mittlerweile mehr als vierzigjährige Geschichte von Neutronen in der biologischen Forschung.

Neutron structure and mechanistic studies of diisopropyl fluorophosphatase (DFPase).
Blum MM, Tomanicek S, John H, Hanson L, Rüterjans H, Schoenborn BP, Langan P, Chen JC.
Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010; 66(11):1131-1138.
http://dx.doi.org/10.1107/S0907444910034013

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Abstract:
Diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) is a calcium-dependent phosphotriesterase that acts on a variety of highly toxic organophosphorus compounds that act as inhibitors of acetylcholinesterase. The mechanism of DFPase has been probed using a variety of methods, including isotopic labelling, which demonstrated the presence of a phosphoenzyme intermediate in the reaction mechanism. In order to further elucidate the mechanism of DFPase and to ascertain the protonation states of the residues and solvent molecules in the active site, the neutron structure of DFPase was solved at 2.2 Å resolution. The proposed nucleophile Asp229 is deprotonated, while the active-site solvent molecule W33 was identified as water and not hydroxide. These data support a mechanism involving direct nucleophilic attack by Asp229 on the substrate and rule out a mechanism involving metal-assisted water activation. These data also allowed for the re-engineering of DFPase through rational design to bind and productively orient the more toxic S stereoisomers of the nerve agents sarin and cyclosarin, creating a modified enzyme with enhanced overall activity and significantly increased detoxification properties.

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