// sie lesen...

Allgemein

Addukte von Nervenkampfstoffen in Phosphatpuffer und ihre Hydrolyse

Reaktionsmechanismus der Bildung von Pufferaddukten mit Nervenkampfstoffen

Adduktbildung in Phosphatpuffer (hier mit GF)

Wir haben kürzlich über die Bildung von stabilen Addukten von Nervenkampfstoffen der G-Reihe wie Sarin, Soman und Cyclosarin mit Puffersubstanzen berichtet, die wie z.B. TRIS, TES oder HEPES Aminoalkohole sind. Die Bildung der hydrolysestabilen Phosphodiester-Addukte hängt dabei sowohl von der Konzentration des Kampfstoffs als auch der Konzentration der Puffersubstanz ab. Wir haben empfohlen für analytische Arbeiten auf diese Puffer zu verzichten und statt dessen auf Substanzen wie MES, MOPS oder CHES zurückzugreifen, die keine Addukte bilden.

Eine weitere in der biologischen, biochemischen und medizinischen Forschung weit verbreitete Puffersubstanz ist anorganisches Phosphat und zwar insbesondere dort, wo der pH auf den physiologischen Wert von 7.4 gepuffert werden soll. Uns interessierte, ob die bei diesem pH vorliegenden Phosphatspezies als Nukleophile mit G-Kampfstoffen reagieren können und mit diesen ebenfalls Addukte bilden. Dies ist in der Tat der Fall. Wir konnten zeigen, dass die Kampfstoffe in Phosphatpuffer deutlich schneller hydrolysieren, als z.B. in MOPS Puffer bei gleichem pH. Darüber hinaus konnten wir auch die Bildung signifikanter Mengen von pyrophosphat-ähnlichen Addukten (phosphorylierte Methylphosphonate) feststellen. Diese hydrolysieren langsam, wobei eine Kinetik pseudo-nullter Ordnung zu beobachten ist. Dies führt zu einem komplexen Gemisch von phosphorhaltigen Verbindungen mit zeitlich wechselnden Konzentrationen. Die molekulare Struktur dieser Addukte konnte durch 1D 1H–31P HSQC NMR and LC–ESI-MS/MS Techniken aufgeklärt werden. Die Reaktionsgeschwindigkeit der Adduktbildung ist vergleichbar mit der Geschwindigkeit der Hydrolyse zum primären Hydrolyseprodukt und führt zur Bildung signifikanter Mengen des Addukts innerhalb von wenigen Minuten.

Als aktives Nukleophil postulieren wir das Hydrogenphosphatanion. Die andere bei diesem pH vorliegende Spezies, das Dihydrogenphosphat ist weniger nukleophil. Die beobachtete Hydrolysekinetik pseudo-nullter Ordnung des Addukts kann damit erklärt werden, dass nur ein sehr kleiner Teil bei pH 7.4 als neutrale Verbindung vorliegt, während die anionischen Spezies vor Hydrolyse geschützt sind (wie z.B. Phosphodiester) und in deutlichem Überschuss vorliegen. Dies führt dazu, dass die Konzentration der reaktiven neutralen Verbindung über lange Zeit konstant bleibt und so eine Kinetik nullter Ordnung beobachtet wird. Für den Fall der Prallelreaktion, die zum primären Hydrolyseprodukt führt, nehmen wir an, dass das Hydrogenphosphatdianion als Base wirkt und diese Reaktion basenkatalysiert verläuft, was zu einer Reaktionsbeschleunigung im Vergleich zur Reaktion bei gleichem pH in MOPS-Puffer führt.

Formation of pyrophosphate-like adducts from nerve agents sarin, soman and cyclosarin in phosphate buffer: Implications for analytical and toxicological investigations.
Gäb J, John H, Blum MM.
Toxicol. Lett. 2011; 200(1):34-40.
http://dx.doi.org/10.1016/j.toxlet.2010.10.011

Abstract:
Phosphate buffer is frequently used in biological, biochemical and biomedical applications especially when pH is to be controlled around the physiological value of 7.4. One of the prerequisites of a buffer compound among good buffering capacity and pH stability over time is its non-reactivity with other con- stituents of the solution. This is especially important for quantitative analytical or toxicological assays. Previous work has identified a number of amino alcohol buffers like TRIS to react with G-type nerve agents sarin, soman and cyclosarin to form stable phosphonic diesters. In case of phosphate buffer we were able to confirm not only the rapid hydrolysis of these agents to the respective alkyl methylphosphonates but also the formation of substantial amounts of pyrophosphate-like adducts (phosphorylated methylphos- phonates), which very slowly hydrolyzed following zero-order kinetics. This led to a complex mixture of phosphorus containing species with changing concentrations over time. We identified the molecular structure of these buffer adducts using 1D 1H–31P HSQC NMR and LC–ESI-MS/MS techniques. Reaction rates of adduct formation are fast enough to compete with hydrolysis in aqueous solution and to yield substantial amounts of buffer adduct over the course of just a couple of minutes. Possible reaction mechanisms are discussed with respect to the formation and subsequent hydrolysis of the pyrophosphate-like compounds as well as the increased rate of hydrolysis of the nerve agent to the corresponding alkyl methylphosphonates. In summary, the use of phosphate buffer for the development of new assays with sarin, soman and cyclosarin is discouraged. Already existing protocols should be carefully reexamined on an individual basis.

Diskussion

Keine Kommentare für “Addukte von Nervenkampfstoffen in Phosphatpuffer und ihre Hydrolyse”

Post a comment

Neuere Kommentare

Neuester Tweet


Häufig verschickt