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DFPase in Mikroemulsionen auf der Basis von Zuckertensiden

Cryo-SEM Mikrographien der Mikroemulsion bei verschiedenen Auflösungen

Cryo-SEM Mikrographien der verwendeten Mikroemulsion

Im Gegensatz zu den normalerweise als Emulsionen bekannten Markoemulsionen weisen Mikroemulsionen ein sehr kleine Domänengröße (Tröpfchengröße) auf, die in der Regel < 350 nm ist. Daher streuen Mirkoemulsionen das Licht nicht und erscheinen daher als klare homogene Flüssigkeiten. Desweiteren sind Mikroemulsionen thermodynamisch stabil, d.h. sie entmischen sich nicht spontan, ein Vorgang der bei Makroemulsionen in der technischen Anwendung ein Problem darstellt. In sog. bikontinuierlichen Mikroemulsionen, die Gegenstand der hier besprochenen Arbeit sind, zeigt sich als Besonderheit, dass es nicht zur Ausbildung von Micellen in Tröpchenform in einer kontinuierlichen Phase kommt (wie in klassischen Öl in Wasser oder Wass in Öl Emulsionen), sondern das sowohl die Wasser- als auch die Ölphase jeweils als kontinuierliche Phase vorliegen, wobei sich eine schwammartige Struktur ausbildet(siehe Abbildung). Solche bikontinuierlichen Mikroemulsionen sind als Trägermatrix für Dekontaminationsmittel von großem Interesse, da sie hydrophobe Kampfstoffe wie z.B. VX effektiv lösen und es aufgrund der sehr großen inneren Grenzfläche zu effektiven Transportprozessen in die wässrige Phase kommt, wo hydrophile reaktive Bestandteile wie z.B. Oximatanionen oder Enzyme zu einer chemischen Umsetzung und Entgiftung des Kampfstoffs führen. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Mikroemulsion eingesetzt, die als Emulgator Zuckertenside enthält. Diese zeichnen sich durch gute Eigenschaften als Lösungsvermittler aus und sind darüber hinaus gut biologisch abbaubar und auch verträglich auf der menschlichen Haut. Als reaktive Komponente kam das Enzym Diisopropyl Fluorophosphatase (DFPase) zum Einsatz, das Kampfstoffe der G-Reihe wie Sarin und Soman effektiv durch Hydrolyse entgiftet. Die Struktur der Mikroemulsion, bei der Cyclohexan als Ölphase dient, wurde mit Hilfe einer Reihe von Beugungsexperimenten untersucht, darunter Dynamic Light Scattering (DLS), Small Angle Neutron Scattering (SANS) und Neutronen Spin-Echo (NSE) Spektroskopie. Darüber hinaus wurden die Eigenschaften von DFPase in wässriger Pufferlösung untersucht. Hier wurde ein hydrodynamischer Radius von R=2,34 nm bestimmt, was zusammen mit dem Diffusionkoeffizienten in sehr guter Übereinstimmung mit den Vorhersagen war und die globuläre Form des Enzyms bestätigte, wie sie mit Hilfe von Röntgenbeugungs bereits bestimmt wurde. Die untersuchte Mikroemulsion wies eine Domänengröße von 15-16 nm auf. Die Zugabe des Enzyms veränderte die Struktur der Emulsion nicht und die DFPase ist ausschließlich, wie zu erwarten, in der wässrigen Phase lokalisiert. Die Aktivität des Enzyms wurde mit Hilfe von 1D 1H–31P HSQC NMR Spektroskopie bestimmt. Der pH der wässrigen Phase hatte hierbei einen Wert von 7,5. Hier zeigt sich mit dem Kampfstoff Sarin (GB) als Substrat eine etwa um die Hälfte verminderte Aktivität im Vergleich zur wässrigen Lösung. Dies kann leicht durch Erhöhung der Enzymmenge ausgeglichen werden. Zur Erklärung für diese Verminderte Aktivität muss berücksichtigt werden, dass das Substrat zum Teil in der Ölphase gelöst ist und die effektive Substratkonzentration für das Enzym daher niedriger ist. Hinzu kommen komplexe Interaktionen zwischen chemischem Abbau in der Wasserphase und Transportprozessen über die Phasengrenzfläche aus der Ölphase heraus. Die Aktivitätsmessungen wurden am Bundeswehr Institut für Pharmakologie und Toxikologie in München und die Neutronenexperimente wurden an der Neutronenquelle in Saclay, Frankreich und am FRM-II in München durchgeführt.

The DFPase from Loligo vulgaris in sugar surfactant-based bicontinuous microemulsions: structure, dynamics, and enzyme activity.
Wellert S, Tiersch B, Koetz J, Richardt A, Lapp A, Holderer O, Gäb J, Blum MM, Schulreich C, Stehle R, Hellweg T.
Eur. Biophys. J. 2011; 40(6):761-74.
http://dx.doi.org/10.1007/s00249-011-0689-0

Abstract:
The enzyme diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) from the squid Loligo vulgaris is of great interest because of its ability to catalyze the hydrolysis of highly toxic organophosphates. In this work, the enzyme structure in solution (native state) was studied by use of different scattering methods. The results are compared with those from hydrodynamic model calculations based on the DFPase crystal structure. Bicontinuous microemulsions made of sugar surfactants are discussed as host systems for the DFPase. The microemulsion remains stable in the presence of the enzyme, which is shown by means of scattering experiments. Moreover, activity assays reveal that the DFPase still has high activity in this complex reaction medium. To complement the scattering experiments cryo-SEM was also employed to study the microemulsion structure.

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