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Enzyme

Diese Kategorie enthält 6 Beiträge

DFPase in Mikroemulsionen auf der Basis von Zuckertensiden

Mikroemulsionen sind klar, thermodynamisch stabile Flüssigkeiten, die interessante Eigenschaften für die Dekontamination von chemischen Kampfstoffen aufweisen. Wir haben das Verhalten und die Aktivität des Enzyms DFPase in einer solchen Mikroemulsion untersucht. Die verwendete Emulsion war bikoninuierlich und hatte eine schwammartige Struktur. Dies führt zu einer sehr großen inneren Phasengrenzfläche. Dies wurde durch Beugungsexperimente (u.a. Dynamic Light Scattering, Small Angle Neutron Scattering und Neutron Spin-Echo) bestätigt. Ebenso konnte gezeigt werden, dass die DFPase in der Emulsion stabil und aktiv ist. Mikroemulsionen stellen daher eine interessante Matrix für Dekontaminations-Enzyme dar, da sie hydrophobe Kampfstoffe effektiv lösen können.

Neutronenstruktur und mechanistische Untersuchungen der DFPase

In einem neuen Artikel im Journal Acta Crystallographica D diskutieren wir zusammenfassend die Neutronenstruktur der DFPase und Untersuchngen zum Reaktionsmechanismus des Enzyms. Es werden drei für die DFPase diskutierte Mechanismen diskutiert. Zum einen der ursprüngliche Vorschlag aus dem Jahr 2001, in dem der Histidinrest 287 eine Wassermolekül aktiviert, dass dann wiederum das Phosphoratom des durch Koordination an das katalytische Calciumion aktivierten Substrats nukleophil angreift, zum anderen den im Jahr 2006 vorgeschlagenen Mechanismus, der über ein Phosphoenzymintermediat verläuft und zur Zeit als der gültige angesehen wird. Als drittes wird ein Mechanismus diskutiert und verworfen in dem das Calciumion ein Wassermolekül direkt als nukleophil aktiviert. Der Artikel macht deutlich, das neben strukturellen Untersuchungen auch weitergehende Mutagenesestudien und sonstige mechanistische Untersuchungen für das verständnis von Enzymechanismen wesentlich sind, die Neutronenbeugungsstruktur der DFPase jedoch wichtige und unentberliche Daten geliefert hat.

Röntgenstruktur von perdeuterierter DFPase – Perdeuterierung von Proteinen für Neutronenbeugungexperimente

Die Perdeuterierung von Proteinen ist eine vieldiskutierte Strategie, um die durch inkohärente Streuung verursachten Probleme bei Neutronenbeugungsexperimenten zu überwinden, da Deuterium einen viel kleineren inkohärenten Streuquerschnitt aufweist als das gewöhnliche Wasserstoffisotop. Hierzu ist die Expression des Proteins in perdeuteriertem Medium notwendig. Wir berichten über die Röntgenstruktur des Enzyms DFPase, die praktisch keinerlei Unterschiede zur nichtdeuterierten Struktur aufweist. B-Faktoren und RMSD-Werte werden vergleichend besprochen. Obwohl ein sehr großer perdeuterierter DFPase-Kristall gezüchtet werden konnte, beugte dieser keine Neutronen. Gründe für dieses unerwartete Verhalten werden diskutiert. Die Struktur wird in einer neuen Veröffentlichung in Acta Cryst. F präsentiert.

Charakterisierung der katalytischen Calciumbindungsstelle der DFPase und Vergleich mit anderen beta-propeller Enzymen

Die katalytische Calciumbindungsstelle des Enzyms DFPase zeigt große Ähnlichkeit mit Metallbindungsstellen in strukturell verwandten Proteinen wie Paraoxonase (PON1), Drug Resistance Protein 35 (Drp35) aus S. aureus oder der Gluconolactonase XC5397 aus Xanthomonas campestris. Enzymutanten der DFPase in denen Reste der Metallbindungsstelle verändert wurden und ihre strukturelle Charakterisierung erlauben neue Aussagen in Bezug auf Metallbindung und katalytische Aktivität. Die Ergebnisse sind in einer neuen Veröffentlichung in Chemico-Biological Interactions (CBI) beschrieben. Der Artikel ist Teil eines Sonderbandes anläßlich des 10th International Meeting on Cholinesterases, das im September 2009 in Kroatien stattfand.

Umkehrung der Enantioselektivität der DFPase durch rationales Proteindesign

Aufbauend auf den Erkenntnissen zur Struktur und zum Reaktionsmechamismus des Enzyms DFPase, konnte durch rationales Proteindesign die Selektivität des Enzyms für das weniger giftige Stereoisomer umgekehrt werden. Die erzeugten Enzymmutanten bauen jetzt nicht nur das giftigere Stereoisomer bevorzugt ab, sondern tun dies auch mit einer höheren Aktivität als der Wildtyp. Die Ergebnisse sind in einer neuen Veröffentlichung im Journal of the American Chemical Society (JACS) beschrieben.

Neutronenstruktur des Enzyms DFPase

Eine neue Veröffentlichung im Journal Proceeding of the National Academy of Sciences of the USA (PNAS) beschreibt die Neutronenstruktur des Enzyms DFPase. Die Technik der Neutronenbeugung erlaubt die Visualisierung von Wasserstoffatomen in Proteinstrukturen und ermöglicht somit Aussagen über Protonierungszustände und die Orientierungen von Wassermolekülen. Es gelang den vorgeschlagenen Mechanismus der DFPase zu bestätigen, was wiederum für gezielte Verbesserungen des Enzyms durch Mutagenese verwendet werden kann.

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